CircRNA鉴定及研究方法
环状RNA（Circular RNA，缩写为CircRNA）属于非编码RNA（non-coding RNA, ncRNA），是近些年新兴的一个重要研究热点。CircRNA是一类不具有5'端帽子和3'端poly(A)结构，并且以共价键形成环状分子结构的RNA分子（图1）。CircRNA主要是通过反向剪接（back-splicing）的方式产生，明显不同于线性RNA（linear RNA）经典的5'–3'的模式。
每一个研究热点背后都有它的背景故事，从不被认知到受到广泛的亲赖。下面，就让我们一起看一下CircRNA的发现史。
CircRNA发现史
◆ 1976年，美国农业部的科研工作者在马铃薯纺锤块茎病的研究中发现类病毒（Viroids）能侵染植株并导致死亡。但与常规病毒不同的是，发现的类病毒并没有蛋白质外壳包被，核酸是单链、闭合、RNA分子。
◆ 1979年，洛克菲勒大学的Hsu和Coca-Prados，用电子显微镜在真核细胞细胞质中观测到环状RNA的存在，这为CircRNA存在提供了最直接的证据。
◆ 1991年，Nigro在HCT116等人源细胞DCC基因中发现转录的CircRNA。
◆ 1993年，Capel在成年小鼠睾丸中发现精子决定基因Sry中存在CircRNA的转录。
◆ 2006年，Houseley在果蝇中发现来自于Muscleblind基因的未知环状转录本。
◆ 2012年，Salzman通过RNA-Seq方法首次报道了大约80个环状RNA分子。至此借助于高通量测序技术，环状RNA的研究，正式开始大量进入人们的视野。
◆ 2013年，Nature杂志两篇重要的研究论文揭示出一些环状RNA充当分子“海绵”，结合并封闭了microRNAs。自此，环状RNA在科学界受到了前所未有的关注。
随着环状RNA功能、作用被逐步揭开，环状RNA的研究也越来越受到重视。接下来，就让我们从CircRNA的分类、作用、鉴定方法和研究方法四个方面，详细的了解下circRNA。
CircRNA的分类
CircRNA在各种动物、植物、昆虫和真菌等均有发现。到目前为止，主要发现了大约183000种人源circRNA，96000种猴源circRNA和82000种鼠源circRNA[1]。与mRNA等线性RNA相比，circRNA在机体内的表达量较少，但表达模式却与其线性同源RNA不同，其表达不依赖于其同源的线性RNA。
CircRNA按照含有的外显子和内含子模式的不同，主要可以分为以下四类：
1) 单外显子circRNA，single exon circRNA；
2) 多外显子circRNA，multi-exon circRNA；
3) 外显子和内含子共存的circRNA，exon-intron circRNA；
4) 内含子circRNA，intronic circRNA；
CircRNA的作用
❥ 作为miRNA的sponge/decoy（海绵）
例如：在哺乳动物的大脑中富含的CDR1as（也称作ciRS-7）包含有70多个miR-7的保守结合位点，在人源细胞系中减少CDR1as的表达，可以显著的减少包含有miR-7结合位点mRNA在细胞中的含量[6]。
❥ 作为RBP（RNA Bingding Protein）的sponge/scafford（海绵）
例如：与动脉粥样化疾病相关的CircANRIL，通过结合核糖体60S亚单元组装因子，来抑制血管平滑肌细胞和巨噬细胞中核糖体的形成，从而造成动脉粥样化的压力和细胞死亡[7]。
❥ 参与蛋白的翻译或其本身被翻译
例如：Circ-ZNF609可以不依赖于剪接和加帽而翻译成蛋白，产生的蛋白在肌肉分化中起到一定的作用[8]。
❥ 调控基因的转录
例如：拟南芥中，SEPALLATA3（也称SEP3）是在花的同源异形表型中所必须的，而CircSEP3可以调控SEP3基因的剪切。CircSEP3来源于SEP3的外显子6，并与之形成了一个RNA-DNA的杂合链，这导致了外显子6的转录终止，从而发生了外显子跳跃，导致产生了一个新的SEP3的mRNA剪切体[9]。
❥ 肿瘤发生的调控
例如：HPV（human papillomavirus）会产生包含有致癌性E7基因的CircE7，其中HPV-16产生的CircE7会翻译生成E7致癌蛋白。在CaSki宫颈癌细胞中，减少CircE7含量会导致E7蛋白的减少，并且会抑制细胞的生长，这项结果在细胞水平上和体内实验都得到了验证[10]。
❥ 神经调控
例如：对正常个体和患有阿尔茨海默氏病个体的顶叶皮层组织进行RNA-Seq分析显示，CircRNA的表达量在早期的时候就有明显的变化，而且这种变化独立于其来源的线性RNA的表达[11]。
CircRNA还可能在免疫、发育等过程中起到重要的作用。
CircRNA的鉴定方法
RNase R消化检测
RNase R是一种来源于大肠杆菌的核酸外切酶，它可以沿RNA的3’-5’方向切割、降解RNA，能够消化几乎所有的线性RNA分子，但不易消化呈环形的RNA、套索结构或3’端突出末端少于7 nt的双链RNA分子（图4）。
RNase R检测并非是必须的，但可以作为一个很典型的实验证明和鉴定circRNA。RNase R主要用于circRNA的鉴定和富集实验，需要根据具体的实验内容和目的决定是否进行RNase R消化。
RNase R并不是绝对的不能消化circRNA，消化时间过长、RNase R的用量过高都有可能会导致在酶消化后CircRNA的含量也有明显降低（图5），所以在使用RNase R进行消化时，还要进行相应的预实验，设置好相应的对照，看是否对于所要研究的CircRNA有明显的影响，保证实验结果的准确性。
qPCR检测
qPCR检测通过引物特异性和位点设计来保证所检测的为环状RNA，一般多用于高通量测序后的数据验证及后续功能研究的定量检测（图6）。Convergent引物作为参照，不管是基因组或线性RNA还是环状RNA均可扩增，而Divergent引物只有环状RNA可以被扩增出来。
如果是以qPCR进行定量检测，一般可以不做RNase R检测，即不需要对circRNA进行富集（线性RNA被消化）。
RNA-Seq检测
CircRNA可以通过RNA-seq技术进行大规模的鉴定，由于CircRNA在总RNA的含量占比比较低，为了增加CircRNA的检出种类和检出效果，一般会对CircRNA进行富集。富集的方法有很多种，大体上的原理都是通过技术手段去掉总RNA中不需要的RNA来达到富集的目的，比如使用RNase R消化总RNA、使用探针结合并去除核糖体RNA等。
进行RNA测序后，就可以使用生物信息学工具或方法在全基因组范围内鉴定circRNA。目前基于RNA-seq测序数据鉴定circRNA的方法主要是通过检测是否有read能匹配到back-splicing junction (BSJ) site来判断，即circRNA的首和尾连接处的序列。
CircRNA的研究方法
随着对CircRNA的了解，研究方法也在不断的成熟。这里我们为大家整理了近年来的CircRNA的研究方法，供大家参考[1]
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参考文献
[1] The expanding regulatory mechanisms and cellular functions of circular RNAs. Molecular Cell Biology.
[2] Electron microscopic evidence for the circular form of RNA in the cytoplasm of eukaryotic cells.Nature.
[3] Circular RNAs: Biogenesis, Function and Role in Human Diseases. Frontiers in Molecular Biosciences.
[4] Circular RNAs in the Mammalian Brain Are Highly Abundant, Conserved, and Dynamically Expressed. Molecular Cell.
[5] Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency.Nature.
[6] Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency. Nature.
[7] Expression of linear and novel circular forms of an INK4/ARF- associated non- coding RNA correlates with atherosclerosis risk. PLoS Genet.
[8] Circ-ZNF609 is a circular RNA that can be translated and functions in myogenesis. Mol. Cell
[9] A circRNA from SEPALLATA3 regulates splicing of its cognate mRNA through R-loop formation. Nat. Plants.
[10] Transforming activity of an oncoproteinencoding circular RNA from human papillomavirus. Nat. Commun.
[11] An atlas of cortical circular RNA expression in Alzheimer disease brains demonstrates clinical and pathological associations. Nat. Neurosci.
