mRNA体外合成质控要点
自新冠疫情爆发以来，疫苗研发一直是医药界密切关注的对象。到目前为止，被批准进入临床试验的疫苗类型主要包括：灭活疫苗、核酸疫苗、载体疫苗、亚单位疫苗、病毒样颗粒疫苗和减毒活疫苗。而核酸疫苗中的mRNA疫苗凭借其独特的优势，迅速在疫苗研发领域占据一席之地。
mRNA疫苗的优势：
· 导入细胞后表达相应的抗原蛋白，无需体外蛋白表达、纯化过程。
· 刺激机体免疫系统产生免疫应答。
· 递送系统具有类似佐剂的部分特性，可增强机体的免疫反应。
· 通过细胞正常代谢完成mRNA的降解，安全性更高。
mRNA疫苗在多种传染病（流感病毒、埃博拉病毒和寨卡病毒）的临床研究中已经取得一定的研究进展，但依然存在一些问题，如mRNA本身具有的潜在免疫原性、递送系统的稳定性、纳米剂型安全性及所使用阳离子聚合物/脂质体安全性等。此外，虽然mRNA疫苗生产规模相对简单，但通常采用的是较为复杂的制剂系统，其药学研发和生产控制也更加复杂，因此从疫苗的有效性、安全性和质量可控性考虑，mRNA疫苗的质量控制就显得格外重要。
在2020年公布的《新型冠状病毒预防用mRNA疫苗药学研究技术指导原则（试行）》中，对mRNA疫苗生产过程中的质量标准做出了明确要求。mRNA的体外合成的生产工艺包括DNA转录模板制备、mRNA原液制备、制剂中间产物检测和成品检测。
DNA转录模板的制备
通常是利用大肠杆菌来扩增目的基因，随后进行质粒纯化和模板线性化。此阶段关键的质控项目包括DNA模板浓度/含量、测序、纯度、杂质残留、微生物限度、内毒素等。其中，转录模板中的杂质残留可能包括宿主菌DNA、宿主菌RNA、宿主蛋白残留等，这些残留会显著影响体外转录的效率，因此需要对模板纯度进行严格的质控。
mRNA原液制备
通常采用转录模板进行mRNA体外转录、mRNA加帽、去磷酸化、DNA酶处理、mRNA纯化等步骤获得mRNA原液。mRNA修饰（如修饰核苷的加入）、加Poly(A)尾通常在转录过程中进行；加帽可在转录过程中同时进行，也可作为单独的工艺步骤。此阶段关键的质控项目包括：加帽率、加Poly(A)尾产物长度、mRNA序列完整性、序列准确性、纯度、mRNA浓度、产品相关杂质（不完整mRNA、截短RNA等）、工艺相关杂质（残留蛋白、残留DNA）、无菌、内毒素等。
制剂中间产物检测
mRNA的非病毒递送系统主要包括但不限于基于脂质的递送系统（如核酸脂质复合物（lipoplexes）和阳离子脂质体等）、基于聚合物的载送系统（如polyplexes等）、基于脂质和聚合物的载体系统（如lipopolyplexex等）。mRNA包封/装载的过程一般系以聚阳离子材料或正电荷脂质等材料与mRNA复合后直接成粒，或成粒后再经包覆形成核壳形结构的过程。制剂制备过程还包括后续纯化步骤，以去除未包封/装载的mRNA、游离的聚合物或脂质材料和/或包封过程中引入的有害物质。基于mRNA递送系统制备工艺的实际情况，对制剂中间产物进行质控检测，关键的质控项目包括纳米颗粒大小及分散系数（PDI）、Zeta电位、正电荷材料相关杂质、不饱和脂质的氧化及相关降解产物、纳米颗粒聚集产生的颗粒物、未组装的脂质分子、阳离子物质、未包封的mRNA等。
成品检测
除了上述检测项目之外，mRNA疫苗还应进行体内或体外生物学活性检测。研发早期阶段建议根据质量研究部分选择适宜的方法建立体内效力质控检测；必要时，根据产品的作用机理建立细胞免疫检测活性的质控检测。
mRNA体外合成质控要点总结
疫情当前，国内外许多企业和机构大量投入研发，建立mRNA疫苗新型研发平台。作为国产生物试剂优质供应商，全式金为这些企业提供一系列相关产品，助力mRNA疫苗研发。
1. TransStart® FastPfu Fly DNA Polymerase (AP231)
一种用于快速PCR的热启动超高保真DNA聚合酶，该酶扩增速度更快 (6 kb/min)，扩增效率更高，产量更高，保真性更高，灵敏度更高。
· 保真性是EasyTaq® DNA Polymerase的108倍。
· 扩增产物为平端，可直接克隆于pEASY®-Blunt 系列载体中。
· 基因组DNA 片段的扩增 (≤ 15 kb)。
· Plasmid DNA片段扩增 (≤ 20 kb)。
2. EasyPure® HiPure Plasmid MaxiPrep Kit (EM121)
利用硅胶膜离心柱特异地吸附DNA，适用于从≤500 ml LB培养基培养的大肠杆菌中高效地提取质粒DNA，操作简单，提取速度快，DNA纯度高。提取的质粒DNA适用于酶切、连接、转化、测序等实验。
FlyCut® 系列5分钟快速内切酶，配有通用的专利性配方的特殊缓冲液，具有省时、高效（酶切效率高，无星号活性）的特点。
4. Phi29 DNA Polymerase (LP101)
由重组φ29 DNA polymerase 基因的载体，在大肠杆菌中经诱导表达、纯化而成, 分子量为74.4 kDa。具有高保真、高效率、高灵敏度、高产量的特点，用于测序、SNP基因分型、STR/微卫星分析、病毒检测和miRNA检测。
5. MagicPure® Size Selection DNA Beads (EC401)
基于Solid Phase Reverse Immobilization (SPRI) 原理，采用具有独特分离作用的磁珠与缓冲液系统，适用于DNA纯化、DNA浓缩、高通量测序文库构建中DNA片段分选，使用方法可与主流文库构建试剂盒兼容。
6. DNA文库构建（转座酶法/传统DNA建库法）
★TransNGS® Tn5 DNA Library Prep Kit for Illumina® (for 50 ng/5 ng/1 ng DNA) (KP101/KP121/KP111)
★TransNGS® DNA Library Prep Kit for Illumina® (KP201)
7. RNA文库构建
★TransNGS® RNA-Seq Library Prep Kit for Illumina® (KP601)
★TransNGS® Fast RNA-Seq Library Prep Kit for Illumina® (KP701)
mRNA原液制备
1. T7 High Efficiency Transcription Kit (JT101)
利用T7 RNA Polymerase，以含有T7启动子的超螺旋质粒DNA或线性DNA为模板，对T7启动子下游的DNA序列进行高效转录。适用于制备长度超过6000 nt的高浓度RNA，制备的RNA可用于体外翻译、RNase保护实验、RNA剪切以及杂交探针标记等。全式金T7 RNA聚合酶转录试剂盒在每20 μl体系中，1 μg模板可以生成150-280 μg的RNA。
本产品包含牛痘病毒加帽酶、mRNA帽结构2’-O-甲基转移酶和其他加帽反应组分，可用于对T7体外转录(JT101)产生的RNA进行5’加帽修饰，具有高效、高灵活性、操作简便等特点。反应产物为Cap1-mRNA，加帽效率可接近100%，并且帽子结构方向正确，对于mRNA的稳定、转运（出核）、翻译过程均有重要作用。
3. mRNA Poly(A) Tailing Kit (LA201)
本产品反应时不依赖模板的存在，催化ATP转化为AMP并依次掺入到RNA的3’末端，即在mRNA的3’末端加Poly(A) 尾，提高RNA在细胞中的稳定性。本产品具有很高的加尾效率，且可平行放大体系用于在体外转录(JT101)及加帽后(LC101) mRNA的加尾修饰，制备可用于细胞转染的RNA样品。具有高效率、高灵活性、操作简便等特点。
4. MagicPure® mRNA Kit (EC511)
偶联了Oligo (dT)的磁珠与带Poly(A)尾的mRNA特异结合，纯化后的mRNA纯度高，完整性好，得到的mRNA适用于RT-PCR、qRT-PCR、二代测序等。本试剂盒适用于磁棒式高通量核酸提取仪。
5. EasyPure® RNA Purification Kit (ER701)
利用硅胶膜离心柱特异地吸附RNA，纯化经DNase I处理的总RNA产物、体外转录产物、RNA标记产物、合成RNA等，能有效地去除蛋白质、有机化合物、无机盐离子等杂质，操作简便、快速。
6. MagicPure® RNA Beads (EC501)
利用独特的磁珠与缓冲液系统，特异地吸附RNA，纯化去除rRNA的RNA产物，经DNase I处理的RNA产物，纯化体外转录产物、RNA标记产物和合成RNA等。操作简便、快速。
自动核酸提取仪
TS-32/96自动核酸提取仪是采用先进磁珠分离技术的高科技产品，具有自动化程度高，提取速度快，结果稳定，操作简便的优点。全式金作为国内知名的核酸分离纯化技术公司，可提供多种配套提取试剂盒，使仪器的使用范围最大化，成本低廉化。
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参考文献
[1] 新型冠状病毒预防用mRNA疫苗药学研究技术指导原则（试行）
